Tahap pra-analitik merupakan titik kendali yang paling menentukan ketepatan hasil pemeriksaan glukosa darah puasa. Dikarenakan sebagian besar kesalahan laboratorium berakar pada proses pra-analitik, penerapan pemantapan mutu internal (PMI) pada tahap ini menuntut kompetensi dan ketelitian Ahli Teknologi Laboratorium Medik (ATLM) sebagai pelaksana utama. Penelitian ini bertujuan menggambarkan tingkat pengetahuan ATLM dan penerapan PMI pra-analitik pemeriksaan glukosa darah puasa, sekaligus menguji hubungan diantara keduanya di Laboratorium Patologi Klinik RSUD Wangaya Kota Denpasar. Penelitian menggunakan desain analitik dengan pendekatan cross-sectional pada 19 ATLM. Tingkat pengetahuan diukur melalui kuesioner berisi 20 butir pertanyaan, sedangkan penerapan PMI pra-analitik dinilai menggunakan lembar observasi yang memotret pelaksanaan proses pra-analitik secara langsung. Analisis hubungan dilakukan dengan Fisher’s Exact Test karena terdapat sel dengan expected count < 5. Hasil menunjukkan mayoritas ATLM memiliki pengetahuan kategori baik (52,6%), dan penerapan PMI pra-analitik juga didominasi kategori baik (57,9%). Uji Fisher mengonfirmasi adanya hubungan yang bermakna antara tingkat pengetahuan dan penerapan PMI pra-analitik (p < 0,001), dengan kekuatan asosiasi yang sangat kuat (Phi = 0,899). Temuan ini menegaskan bahwa penguatan pengetahuan ATLM merupakan strategi kunci untuk meningkatkan konsistensi dan mutu penerapan PMI pra-analitik pada pemeriksaan glukosa darah puasa.
Kata kunci: glukosa darah puasa, PMI, pra-analitik, tingkat pengetahuan.