Anemia pada kehamilan masih menjadi masalah kesehatan yang memerlukan pemeriksaan hemoglobin secara akurat dan tepat waktu, karena penundaan pemeriksaan sampel darah pada suhu ruang berpotensi memengaruhi hasil melalui faktor pra-analitik. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis perbedaan nilai hemoglobin darah ibu hamil yang diperiksa segera dan setelah penyimpanan 2 jam pada suhu ruang di Puskesmas Mengwi III. Jenis penelitian ini adalah pre eksperimental dengan pendekatan One Group Pretest And Posttest Design pada 45 ibu hamil yang dipilih secara accidental sampling. Hasil penelitian menunjukkan kadar hemoglobin yang diperiksa segera memiliki rata-rata sebesar 11,7 g/dL, dengan standar deviasi 1,2 g/dL, nilai minimum 9,4 g/dL, dan nilai maksimum 14,5 g/dL. Kadar hemoglobin yang disimpan selama 2 jam pada suhu ruang menunjukkan nilai rata-rata sebesar 11,6 g/dL, dengan standar deviasi 1,2 g/dL, nilai minimum 9,4 g/dL, dan nilai maksimum 14,3 g/dL. Terdapat selisih rerata hasil pemeriksaan sebesar 0,1 g/dL dengan selisih nilai maksimum 0,2 g/dL. Hasil analisis perbedaan menggunakan uji paired t-test menunjukkan nilai p value sebesar 0,000, yang menandakan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna secara statistik kadar hemoglobin antara yang diperiksa segera dan setelah penyimpanan 2 jam pada suhu ruang. Penyimpanan darah selama 2 jam pada suhu ruang menyebabkan perbedaan kadar hemoglobin yang bermakna secara statistik, kemungkinan akibat perubahan biologis dan fisik seperti aktivitas metabolik sel darah, perubahan distribusi komponen seluler, pengaruh antikoagulan EDTA, serta kemungkinan perbedaan homogenisasi sampel sebelum dilakukan pemeriksaan ulang.

Kata kunci: Hemoglobin, Ibu Hamil, Pemeriksaan Segera, Penyimpanan Suhu Ruang.