Pemeriksaan glukosa darah puasa memerlukan persiapan pasien yang sesuai dengan instruksi pra-analitik karena ketidaksesuaian persiapan dapat memengaruhi keakuratan hasil pemeriksaan. Tingkat pengetahuan pasien mengenai pemeriksaan glukosa darah puasa diduga berkaitan dengan kepatuhan dalam mengikuti instruksi pra-analitik. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan tingkat pengetahuan pasien tentang pemeriksaan glukosa darah puasa dengan kepatuhan terhadap instruksi pra-analitik di Rumah Sakit X. Penelitian ini menggunakan desain kuantitatif observasional analitik dengan pendekatan cross-sectional. Sampel penelitian berjumlah 86 responden yang menjalani pemeriksaan glukosa darah puasa. Data dikumpulkan menggunakan kuesioner dan dianalisis menggunakan uji korelasi Spearman Rank. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebagian besar responden memiliki tingkat pengetahuan dalam kategori baik, yaitu sebanyak 62 responden (72,1%), sedangkan responden yang patuh terhadap instruksi pra-analitik sebanyak 76 responden (88,4%). Hasil uji Spearman Rank menunjukkan terdapat hubungan yang signifikan antara tingkat pengetahuan pasien dengan kepatuhan terhadap instruksi pra-analitik (p < 0,001; r = 0,582), dengan kekuatan hubungan sedang dan arah positif. Temuan ini menunjukkan bahwa semakin baik pengetahuan pasien, semakin tinggi kecenderungan pasien untuk mematuhi instruksi pra-analitik pemeriksaan glukosa darah puasa. Pengetahuan yang baik membantu pasien memahami informasi mengenai pentingnya mengikuti instruksi pra-analitik untuk memperoleh hasil pemeriksaan yang akurat. Namun, kekuatan hubungan yang sedang menunjukkan bahwa kepatuhan tidak sepenuhnya dipengaruhi oleh pengetahuan, tetapi juga dapat berkaitan dengan faktor lain, seperti motivasi dan dukungan keluarga. Oleh karena itu, edukasi mengenai persiapan pemeriksaan glukosa darah puasa perlu ditingkatkan sebagai salah satu upaya untuk meningkatkan pengetahuan dan kepatuhan pasien terhadap instruksi pra-analitik.